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练习4：找到配对的CRISPR位点

一种提高CRISPR / Cas9靶向特异性的方法是使用突变体Cas9-D10A切口酶以及与靶位点的相对链互补的一对引导RNA。相反链上的两个单独切口模拟双链断裂，然后导致非同源末端连接。脱靶相互作用被最小化，因为任何单个脱靶切口将通过碱基切除修复途径以更高的保真度被修复。

在本练习中，您将使用Find CRISPR Sites在LYP1 CDS上查找配对位点。选择LYP1 CDS文档（geneious的demo数据文件，可以下载）并转到克隆→查找CRISPR位点。

和前面的练习保持相同的设置，除了设置速度和过滤策略上慢-评分所有的位点，因为我们想进行评分所有位点的这项工作。

要找到配对的CRISPR位点，请勾选Pair CRISPR sites旁边的复选框。您可以指定返回位点的最大允许重叠，以及配对位点之间允许的最大空间。位点之间的最大重叠和最大空间从CRISPR位点的5'，PAM远端测量。我们将分别使用默认选项6和16。

对话框现在应该如下图所示。点击确定运行搜索。

Geneious已经注释了三对CRISPR位点。

当使用Pair CRISPR位点选项时，Geneious将只注释至少有一对位点给定位点设置之间的最大重叠和最大空间。在这些设置中没有配对的位点没有注释。

每对CRISPR位点都有一个“配对的CRISPR评分”。如果您将鼠标放在其中一个CRISPR注释上，则可以查看该位点的配对CRISPR分数。这个综合分数是两个CRISPR分数的平均值。具有最高综合得分的CRISPR位点对相关联。每个CRISPR位点都将链接到其得分最高的配对位点，除非该第二个位点与另一个位点的得分更高。这对位点根据他们的配对分数进行着色，而不是他们各自的CRISPR分数。

恭喜，你现在已经完成了CRISPR教程。完结。